杨恒
- 作品数：45 被引量：134H指数：9
- 供职机构：云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金国家公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 云南省中山病毒的分离鉴定被引量：4
- 2020年
- 为掌握云南省虫媒病毒的流行情况及基因分型,本试验在云南省师宗、江城和芒市设立监控点,对哨兵动物定期采血来监测其血清转阳情况,将阳性样品在BHK上传代以分离病毒,用RT-PCR及MNT鉴定病毒,通过特异性引物扩增分离毒株的Segment2(Seg-2)及Segment7(Seg-7)基因片段来分析其遗传特性。结果显示,在2014年从师宗监控点分离得到4株帕利亚姆病毒(PALV),经鉴定均为中山病毒(Chuzan virus,CHUV),并掌握了分离株Seg-2及Seg-7基因片段的遗传特征。本试验确认了CHUV在云南省的分离,为进一步掌握CHUV在中国的流行病学、致病性以及疫苗研究奠定良好基础。
- 朱沛孟锦昕牛保生姚萍芬杨恒朱建波肖雷李华春
- 版纳病毒和芒市病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立及应用
- 2022年
- 为建立版纳病毒(BAV)和芒市病毒(MSV)的可视化RT-LAMP检测方法,根据我国分离的BAV(YNSZ043)和MSV(V301/YNJH/2019)毒株Seg-12基因的保守序列,分别设计2对特异性引物和1条环引物,通过反应条件优化,分别建立了2种病毒的可视化RT-LAMP检测方法,其最佳反应条件为64℃50 min,分别利用2种方法检测西藏环状病毒、流行性出血病病毒、蓝舌病病毒、中山病病毒、广西环状病毒和阿卡斑病毒等虫媒病毒的核酸样品,结果2种方法仅能分别检测出BAV和MSV,其他虫媒病毒均无非特异性扩增。灵敏度试验检出BAV和MSV的最低检测限制分别为13.7拷贝/μL和19.0拷贝/μL,敏感性是常规RT-PCR的10倍以上。应用2种病毒的RT-LAMP及RT-PCR方法分别对2596只蠓虫和蚊虫的核酸样品进行检测,结果阳性检出率均是RT-PCR的2倍以上。结果表明,建立的BAV和MSV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高和可视化等优点,为我国开展2种病毒的现场快速检测与流行病学研究提供了有效的技术支撑。
- 杨振兴李卓然何于雯李占鸿李乐廖德芳杨恒朱建波
- 关键词：版纳病毒
- 流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定被引量：17
- 2019年
- 流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。
- 杨振兴孟锦昕肖雷朱建波廖德芳高林李占鸿杨恒李华春
- 关键词：病毒分离鉴定血清型
- 2013~2016年中国流行性出血病病毒血清型5型的分离与遗传特征分析被引量：11
- 2020年
- 流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,全世界已发现9种血清型EHDV,长久以来我国EHDV血清型分布、病毒活动规律和病毒遗传特征不明确,对我国的畜牧业进出口和牛羊养殖业构成了潜在威胁。本文首次报道了2013~2016年在云南省与广西壮族自治区设立的哨兵动物中,9株EHDV-5型毒株的分离以及病毒基因节段2、3与6(Seg-2、Seg-3、Seg-6)的序列特征。中国分离的9株EHDV-5型毒株Seg-2,Seg-3与Seg-6及其编码蛋白之间高度保守,核酸与氨基酸序列相似度均大于99%,在系统发生树上聚为紧密的一簇,表明我国云南与广西流行的EHDV-5有着最近的共有祖先。中国与澳大利亚EHDV-5毒株不同基因节段之间也有着较高的序列相似度(>91%),表明两地流行EHDV-5型毒株有着共同的起源。中国毒株的Seg-2与Seg-6在系统发生树上虽与澳大利亚毒株(CSIRO 157)聚为一簇,但最终形成了独立的进化分支,表明中国流行的EHDV-5发生了独立的进化。本研究首先丰富了世界范围内EHDV-5型毒株资源,其次为我国开展EHDV-5病毒的更深入研究提供了宝贵材料和理论数据。
- 杨振兴李占鸿吴健敏王金萍肖雷寇美玲朱建波廖德芳李华春杨恒
- 关键词：血清型
- 云南蓝舌病病毒1型毒株M6基因序列分析被引量：8
- 2016年
- 为了解云南蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1（Y863、SZ120169、6-12和7-12）RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测序,采用生物信息学软件对获得的M6基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析。结果表明,分别获得4株云南分离株BTV-1 M6基因1 763bp序列;4株云南分离株BTV-1核苷酸同源性在95.2%-99.9%之间,氨基酸同源性在97.6%-99.8%之间,1979年师宗分离的Y863病毒毒株与2012年师宗（SZ120169）、2013年江城（6-12、7-12）分离的3株病毒毒株核苷酸同源性分别为95.5%、95.2%和95.2%,氨基酸同源性分别为97.6%、98.4%和98.2%,而近两年（2012、2013）分离病毒核苷酸和氨基酸同源性较高,分别在96.9%-99.9%和99.1%-99.8%之间;遗传进化分析发现,4株云南分离株BTV-1为Eastern基因群病毒,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%-99.9%和97.6%-99.8%;进一步分析发现4株云南分离株BTV-1与希腊及澳大利亚BTV-1型毒株亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.4%-95.6%和95.1%-99.1%,而与地中海国家（意大利、法国、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯）和南非毒株关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别在83.8%和95.7%以下。4株云南分离株BTV-1属于Eastern基因群病毒,云南分离株BTV-1 M6基因在自然进化中发生遗传变异缓慢,该基因可以用来进行BTV-1基因群分布及毒株的地理区域来源相关的研究。
- 李楠朱建波肖雷李乐杨恒孟锦昕何于雯李华春
- 关键词：蓝舌病病毒
- 云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定被引量：15
- 2014年
- 为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况，2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5-10月，每周采血1次，11-12月，每月采血1次，采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性，至11月，监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2-13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚，收获鸡胚肝脏，用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏，上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后，出现细胞病变（cytopathic effect, CPE）。采用RT-PCR方法，针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物，扩增其相应片段。结果显示，共分离到86份疑似分离物，其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增，均扩增出1156 bp片段，初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验，67份毒株为蓝舌病病毒，与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现，BTV-1株序列与同型Y863（登录号：KC879616）参考毒株的同源性为92%，BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株，分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。
- 肖雷孟锦昕李楠高林何于雯杨恒胡骑李华春朱建波
- 关键词：蓝舌病病毒
- 云南省边境地区哨兵牛芒市病毒的分离与鉴定被引量：4
- 2021年
- 【目的】掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2055和1122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa)和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3055和1076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa)和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4%(Seg-9)~98.5%(Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14),在第16~18周处于高峰(1∶226),至监测结束的第24周降低为1∶57。【结论】本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。
- 李占鸿谢佳芮杨振兴寇美玲李华春高翔胡忠燕李卓然廖德芳杨恒
- 关键词：虫媒病毒系统发生分析
- 一株新型牛源流行性出血病病毒的分离与鉴定被引量：3
- 2021年
- 为分析云南省动物流行性出血病病毒(EHDV)的流行情况,本研究将2018年采集的280份牛EDTA抗凝血液样品通过EHDV群特异性qRT-PCR和血清型特异性qRT-PCR方法进行病毒核酸检测,利用竞争性ELISA(C-ELISA)检测牛常规血液样品中的抗体水平,将EHDV核酸阳性牛血液样品先接种白纹伊蚊(C6/36)细胞再接种BHK-21细胞进行病毒分离;利用血清型特异性qRT-PCR和血清中和试验分别鉴定分离病毒的血清型;通过蚀斑特征和增殖曲线分析分离病毒的增殖特性;经全长cDNA扩增技术(FLAC)获得分离病毒的Seg-2和Seg-3基因序列,并分析其同源性及遗传进化关系;采用C-ELISA和qRT-PCR对感染牛体内的抗体和病毒核酸进行回溯检测。结果显示,280份牛EDTA抗凝血样品中共有35份样品呈EHDV核酸阳性,其中13份为EHDV-1型,11份为EHDV-5型,另外11份均未有已知血清型的特异性扩增曲线。共分离到3株病毒,经EHDV血清型特异性qRT-PCR鉴定其中两株分别为EHDV-1和EHDV-5型,但无法判定其中一株病毒(YNDH/V079/2018株)的血清型。蚀斑特征和增殖曲线结果显示,该株病毒的蚀斑明显小于EHDV-1、EHDV-5和EHDV-6型,而与EHDV-7和EHDV-10型接近,但其增殖特性则与上述血清型EHDV均相似。序列分析结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3/VP3与GenBank中EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列的同源性分别为78.5%~80.0%/94.6%~96.5%,表明其为一株EHDV;但其Seg-2/VP2与GenBank中各血清型EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为44.3%~50.9%/31.0%~40.6%,表明该株病毒不属于已知血清型的EHDV。系统进化树结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3基因形成一个单独的进化分支,不属于已报道的东方和西方两种地域型;且其Seg-2基因也不属于已知血清型EHDV形成的A~D 4个基因群,而是单独形成了E基因群。感染牛的回溯检测结果显示,牛感染YNDH/V079/2018株后,虽然未出现临床症状,但被感染�
- 李卓然王金萍杨振兴李占鸿廖德芳李华春杨恒
- 关键词：病毒分离血清型
- 云南牛血液标本中哺乳动物正呼肠孤病毒(YNSZ/V207/2017)的分离鉴定被引量：2
- 2022年
- 目的掌握云南省动物病毒的多样性和传播风险。方法在云南省师宗县设立10头哨兵牛,定期采血接种细胞进行病毒分离。通过RT-PCR、电镜观察、高通量测序与血清中和试验进行分离病毒的鉴定、全基因组序列获取与流行病学调查。结果2017年从采集的哨兵牛血液样本中分离出2株蓝舌病病毒、3株帕利亚姆病毒、2株流行性出血病病毒和1株待鉴定病毒(YNSZ/V207/2017)。电镜下YNSZ/V207/2017病毒粒子直径约80 nm,呈二十面体对称;全基因组序列分析显示其为哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus,MRV)血清1型毒株(MRV-1),病毒的不同基因节段分别与人、白尾鹿、水貂、果子狸和棕蝠上分离MRV的序列相似度最高;血清中和试验表明当地牛、羊和猪中MRV-1的抗体阳性率分别为32.5%、20.0%和42.5%。结论在云南省牛血液标本中分离出1株MRV-1型毒株,该毒株可能为不同宿主来源的基因重配毒株,MRV-1在当地家畜中广泛流行。
- 李占鸿肖雷李卓然宋子昂谢佳芮杨振兴朱沛李华春廖德芳杨恒
- 关键词：病毒分离全基因组测序基因重配
- 我国牛羊流行性出血病血清抗体调查被引量：10
- 2019年
- 为了解流行性出血病(EHD)在我国的流行和分布情况,本研究采用竞争ELISA试验方法,对2015年～2017年我国吉林、河北、西藏、重庆、云南等15个省区的6 413份牛羊血清样品进行检测。结果显示,未发现绵羊EHDV阳性血清,山羊EHDV血清阳性率较低(0～4%),而牛血清EHDV阳性率有明显的地域性和季节性,由北向南逐渐升高(0～65.83%),表明EHD在我国的流行已具有广泛性;秋季阳性率(61.11%～65%)明显高于春季(10%～16.67%)和夏季(29%～32%),表明该病的流行分布状况与其媒介昆虫的活动有密切关系。本研究是我国首次大规模的EHD血清学调查,对有效防控该病提供了重要的实验数据。
- 杨振兴吕敏娜朱沛杨恒肖雷廖德芳谢佳芮朱建波李华春
- 关键词：血清学调查竞争ELISA
