- 精子特异性锌指蛋白146条件性敲除小鼠的构建及鉴定
- 2020年
- 目的探讨构建精子特异性RNF146敲除小鼠及其鉴定方法。方法从NCBI网站上检索小鼠RNF146的基因序列,分析外显子与各剪接体的关系以及起始密码子和终止密码子所在区域,选择条件性基因敲除片段。构建基于Cre/Lox P系统的RNF146条件性敲除杂合子(RNF146^(flox/+))小鼠(F1代)。取F1代RNF146^(flox/)+杂合子小鼠自交,PCR鉴定其后代基因型,挑选RNF146纯合子敲除(RNF146^(flox/flox))雌鼠与精子特异性Cre转基因雄鼠AQP2-Cre进行杂交。PCR检测其后代基因型,选取AQP2-Cre阳性的RNF146杂合子雄鼠(AQP2-Cre;RNF146^(flox/+))与RNF146纯合子(RNF146^(flox/flox))雌鼠回交后筛选AQP2-Cre阳性的RNF146纯合子小鼠(AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox))即为精子特异性RNF146敲除小鼠。选取9~10周龄(体成熟)的精子特异性RNF146敲除小鼠,从附睾和输精管中分离精子,以AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)小鼠为对照,Real-time PCR及Western blot分析精子中RNF146表达水平确认敲减效率。结果RNF146基因四号外显子被选为敲除区域来构建基于Cre/Lox P系统的条件性敲除小鼠。F1代杂合子(RNF146^(flox/+))小鼠自交后代中约1/4个体为RNF146^(flox/flox);AQP2-Cre转基因工具鼠与纯合子(RNF146^(flox/flox))雌鼠交配后代中具有AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)基因型的小鼠约占1/2;AQP2-Cre;RNF146^(flox/+)雄鼠和RNF146^(flox/flox)雌鼠交配后代中近1/4为AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)小鼠。成年AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)小鼠精子中RNF146 m RNA(Real-time PCR)和蛋白表达水平(Western blot)分别降低77.3%(P<0.001)和89.2%(P<0.001)。结论成功构建精子特异性RNF146条件性敲除小鼠AQP2-Cre;RNF146^(flox/flox)。
- 司胜斌程建华丁敬宾戈锐裴秀英赵薇
- 关键词:精子
- 内源性神经保护蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达及定位
- 2016年
- 目的明确内源性神经保护蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达水平及定位特点。方法取SD新生鼠各器官组织和脑分区,用Western blot评价Iduna蛋白表达的组织特异性;制作SD新生鼠脑组织石蜡与冰冻切片,免疫组织化学观察Iduna蛋白的表达及定位特点;免疫荧光三标脑组织冰冻切片确认Iduna在神经元及星形胶质细胞中的定位;培养原代神经元及星形胶质细胞,real-time PCR定量分析Iduna mRNA在细胞中的表达和免疫荧光双染Neu N和GFAP验证Iduna的细胞定位。结果 Iduna在新生鼠脑组织中表达丰富,尤其是海马和皮层区域。Iduna主要定位在大脑海马神经元细胞的胞质内(79.85%),原代神经元中也验证了这一结果(80.6%)。Iduna mRNA在神经元中的表达丰度远远高于星形胶质细胞(P<0.001)。结论脑组织中Iduna主要分布在海马和皮层区域的神经元胞质中,提示其功能可能与神经元的活动密切相关。
- 杨晓霞赵薇王旭程建华倪新莉
- 关键词:新生鼠神经细胞
- Iduna过表达慢病毒的构建、包装及鉴定被引量:1
- 2016年
- 目的构建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表达质粒(pCDH-Iduna),包装Iduna过表达慢病毒,以期上调原代神经元细胞中Iduna的表达。方法提取SD大鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法获取大鼠Iduna cDNA序列,将其插入慢病毒过表达载体pCDH质粒中,经酶切和测序验证重组质粒pCDH-Iduna。将pCDH-Iduna(以pCDH-EGFP为阴性对照)及包装质粒共转染HEK293T细胞,包装Iduna过表达慢病毒,显微镜下观察HEK293T细胞的形态变化,了解病毒包装情况。用慢病毒感染原代神经元细胞,Western blot检测靶细胞中Iduna的表达效率。结果琼脂糖凝胶电泳显示Iduna的PCR扩增产物大小为1068 bp左右片段,酶切鉴定可见重组质粒pCDH-Iduna有约1000bp左右片段释放,与预期相符,测序结果提示克隆正确。将Iduna过表达慢病毒表达载体pCDH-Iduna及包装质粒共同转染HEK293T细胞后,镜下可见细胞呈现出毒时特有的致细胞病变效应。Iduna过表达慢病毒及其对照病毒感染原代神经元细胞,免疫荧光观察感染率达70%后,Western blot检测病毒感染的神经元细胞中Iduna表达显著增加。结论成功构建大鼠Iduna慢病毒过表达载体pCDH-Iduna并获得具有良好感染效率的过表达慢病毒,后者能够显著上调原代神经元中Iduna的表达。
- 杨晓霞杨慧莹程建华赵薇倪新莉
- 关键词:重组质粒慢病毒
- 锌指蛋白146对小鼠精原细胞化疗后DNA损伤的保护作用研究
- 目的:睾丸是对化疗药物高度敏感的器官,化疗后出现不同程度睾丸功能损伤的患者越来越多,严重影响男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系统及泌尿系统恶性肿瘤[1,2]治疗常用的化疗药。针对体内异常增殖...
- 程建华
- 关键词:肿瘤细胞化疗药物DNA损伤精原细胞
- 锌指蛋白146(RNF146)对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用被引量:1
- 2016年
- 目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表达慢病毒,感染GC-1细胞上调rnf146的表达,Western blot验证过表达效率。评价RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及DNA损伤的保护作用。结果成功构建了p CDH-rnf146重组质粒并包装具有良好感染效率的RNF146过表达慢病毒。溴脱氧尿苷(Brd U)掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1增殖抑制。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)提示RNF146能够抑制吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论 RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。
- 程建华杨晓霞杨慧莹关立锋丁敬宾丁娟赵薇
- 关键词:吡柔比星DNA损伤