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发热伴血小板减少综合征病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用: 2025年; 目的建立一种基于Taqman探针的高灵敏度一步法实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)。方法靶向发热伴血小板减少综合征病毒基因组S片段保守区域设计引物和Taqman探针建立实时荧光定量RT-PCR方法。评价方法的灵敏度、特异性和重复性,并应用临床样本进行应用评价。结果该方法最低检测限为100拷贝/ml,其灵敏度为普通RT-PCR的1000倍。在线性范围内,循环阈值(Ct值)与病毒RNA标准品之间表现出较强的线性相关性(R 2>0.999)。批内和批间重复性的变异系数均小于1.0%。该方法还具有高度特异性,不与其他病毒核酸交叉反应。应用发热伴血小板减少综合征确诊患者和健康志愿者血清样本对该方法进行了评估,结果显示,该方法检测灵敏度和特异度均为100.0%。此外,用该方法对288例疑似SFTSV感染患者的样本进行检测,有14.9%的患者感染了SFTSV。该方法速度较快,包括核酸提取步骤在内仅需2 h。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可作为SFTSV感染早期诊断的可靠方法。; 李鹏飞李全李梦兰吴玲李志锋; 关键词：实时荧光定量RT-PCR 特异性检测限

牛阿卡斑病RT-PCR检测方法的建立: 2025年; 【目的】建立牛阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)RT-PCR实验室快速检测方法,为该病的临床防控提供技术支撑。【方法】参考前期获得的阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)S基因序列(OR791104.1),针对其保守区域设计特异性扩增引物,以构建的pMD-AKAV重组质粒为模板,建立RT-PCR检测方法,并对其扩增条件进行优化,进而对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,最后将所建方法对实验室保存的19份阳性和279份阴性牛血清临床样本进行符合性检测,验证该方法的准确性。【结果】所建方法的最佳反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,共37个循环;72℃延伸5 min。对牛蓝舌病病毒、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体等病原均为阴性,特异性良好;对阳性质粒检测最低限为2.5×10^(3) copies/μL,灵敏性高;重复性试验显示不同批次样本检测结果均一致,可重复性强;对实验室保存的298份(19份阳性、279份阴性)临床样本进行检测,其结果均与预期一致,符合率100%。【结论】建立的牛阿卡斑病RT-PCR检测方法特异性良好、灵敏性高、可重复性强。; 尚佳富李明科徐婷婷杨晓伟刘霞刘霞曹礼静倪兴维赵光伟; 关键词：赤羽病 RT-PCR

福建蝴蝶兰病毒小RNA测序及RT-PCR检测: 2025年; 从福建省福州、厦门、漳州、泉州采集56个蝴蝶兰(Phalaenopsis)疑似病毒样品,按侵染症状分为褪绿、黄化褐斑、黄化皱缩等3类样品,采用小RNA测序技术和RT-PCR进行检测,共发现8种病毒,按照检出率从高到低分别为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,Cy MV)85.71%,齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)35.71%,白三叶草花叶病毒(white clover mosaic virus,WCMV)32.14%,淮山药X病毒(yam virus X,Ya VX)21.43%,水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,Na MV)10.71%,凤果花叶病毒(pepino mosaic virus,Pe MV)8.93%,马铃薯X病毒(potato virus X,Po VX)7.14%和仙人指X病毒(Schlumbergera virus X,Sc VX)7.14%。其中,Cy MV、ORSV和WCMV的检出率在30%以上,多为复合侵染,侵染率达75.51%。以小RNA测序序列为模板,设计出特异引物,建立了同时检测5种病毒的多重RT-PCR体系;ORSV、Cy MV、WCMV、Ya VX和Po VX的引物对浓度分别为0.30,0.06,0.20,0.50和0.40μmol·L^(-1),退火温度56℃时,可同时扩增出片段大小分别为1156、908、561、292和162 bp的目的条带,特异性良好。灵敏度检测结果显示,可从≥0.0001 mg的感病植物组织中检测到这5种病毒。; 樊荣辉吴建设冯子楠钟声远钟淮钦; 关键词：多重RT-PCR 病毒

1种牛轮状病毒Taq-Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立: 2025年; 试验旨在建立一种可简便、快速地检测牛轮状病毒(BRV)的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法,试验通过分析比对NCBI下载的BRV VP7基因序列,在VP7基因的保守区设计两对特异性引物及Taq-Man探针,经反应条件优化,建立BRV的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法。利用建立的检测方法检测标准品,绘制标准曲线,检测方法的特异性、灵敏性和稳定性,并对临床样品及疫苗半成品进行检验。结果显示,建立的Taq-Man荧光定量RT-PCR方法的最低检测限为10 copies/μL,组内和组间重复变异系数(CV)均小于3.50%。检测临床样品和疫苗半成品,疫苗半成品均检测阳性,临床样品检测阳性率69%。研究表明,BRV Taq-Man荧光定量RTPCR检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,对BRV的诊断检测及疫苗生产具有重要的参考价值。; 王秀明陈君彦础鲁刘艳霞; 关键词：荧光定量RT-PCR VP7基因

牛轮状病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用: 2025年; 本研究旨在建立更加灵敏的牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)检测方法,为BRV的病原学调查及畜牧养殖行业疫病防控提供更加准确和灵敏的技术支持。根据BRV VP6基因组序列,利用Oligo7.56软件设计并合成特异性引物与探针,通过优化反应条件,建立检测BRV的微滴式数字RT-PCR方法,同时开展特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于14份临床样品的检测。结果表明,本研究所建方法的最低检测限为1.83 copies/μL,具有良好的可重复性,与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型均无交叉反应。对14份临床样品进行检测,共检测出4份阳性样品,阳性率为28.57%,检测结果与实时荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100.00%。综上说明,本研究建立的BRV微滴式数字RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。; 谢世斌郑辉沙洲房琳琳尼博张慧张慧董雅琴崔进; 关键词：牛轮状病毒 VP6基因

11种致牛腹泻病原的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法的建立被引量：1: 2025年; 【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展,病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法,实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索调查了引起牛腹泻病的主要病原及其高覆盖率的引物,选择以产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α-toxin、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)inv A、大肠杆菌(Escherichia coli)K99、牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)5′-UTR、牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)ORF1a、牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRoV)VP6、牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)D4、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)ORF1、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)N、牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)N、牛病毒性腹泻黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)5′-UTR为靶标序列的引物,通过温度梯度PCR及单一控制变量法优化退火温度、引物浓度、循环数,建立11种病原的多重PCR/RT-PCR检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度和重复性评价,并应用该方法进行临床样品检测。【结果】最佳退火温度为54.4℃,C.perfringens、S.enterica、E.coli、BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV和BVDV对应基因片段最优引物浓度分别为0.20、0.25、0.25、0.20、0.25、0.25、0.35、0.50、0.25、0.25、0.30μmol/L,最优循环数为35个循环。该方法特异性强,仅对靶标病原检测为阳性,对溶血性曼氏杆菌(Mansiella haemolyticus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、牛支原体(Mycoplasma bovine)分离株等病原检测均为阴性;敏感性高,对重组质粒标准品最低检出限依次为7.5×10^(3)、7.5×10^(4)、7.5×10^(3)、7.5×10^(1)、7.5×10^(4)、7.5×10^(2)、7.5×10^(3)、7.5×10^(2)、7.5×10^(2)、7.5×10^(4)、7.5×10^(3)copies/μL;重复性好,批间与批内试验均一致。用该方法检测江苏地区临床样品490份,结果显示,BEV、BAstV、BRoV、BKoV、B; 金美君胡云皓辛凌翔刘燕潘瑶王秀丽赵浩然汤承陈曦李锦铨朱良全; 关键词：腹泻多重PCR RT-PCR

鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用: 2025年; 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。; 陈立功穆英丽张诚潘保革潘保革魏忠华魏忠华王学静; 关键词：荧光定量RT-PCR TAQMAN探针

一种用于检测反刍动物虫媒病毒的四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及使用方法和应用: 一种用于检测反刍动物虫媒病毒的四重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒及使用方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明为解决现有技术中缺少快速、灵敏、特异且能同时检测BTV、EHDV、AKAV、CHUV病毒的检测方法，提供了一...; 齐瑛琳夏长友尹鑫孟庆文

H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用: 2025年; 为同时鉴别检测H3、H4、H6和H9亚型禽流感病毒(AIV),本研究根据上述4种亚型AIV HA基因的保守区,采用primer6.0设计4对特异性引物和TaqMan探针,经PCR扩增上述4种亚型AIVHA基因后,分别克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒p-H3、p-H4、p-H6和p-H9,并均经PCR与测序鉴定正确后作为标准品。通过优化各反应条件,初步建立了检测H3、H4、H6和H9亚型AIV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法。分别以H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9亚型AIV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭圆环病毒(DuCV)、番鸭细小病毒(MDPV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新城疫病毒(NDV)的RNA或者DNA作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;将4个重组质粒标准品等体积混合物10倍倍比稀释后作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR检测,评估该方法的敏感性;选择3个浓度的重组质粒标准品等体积混合物作为模板,采用本研究建立的多重RT-qPCR分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅H3、H4、H6和H9亚型AIV出现扩增曲线,其他相关禽病病原均为阴性,特异性较强;该方法对H3、H4、H6和H9亚型AIV的检测限均为1.0×101拷贝/µL,敏感性较高;批内和批间重复性试验的变异系数为0.06%~1.09%,重复性较好。利用该方法检测来自广西不同地区的3360份临床家禽咽喉、泄殖腔拭子样品,结果显示H3、H4、H6和H9亚型AIV的检出率分别为4.08%(137/3360)、0.21%(7/3360)、1.13%(38/3360)和3.51%(118/3360),与各亚型AIV单一RT-qPCR商品化试剂盒的检测结果均一致,符合率达100%。表明本研究建立的多重RT-qPCR准确性较好,可以用于临床各类样品的检测。本研究建立了一种同时鉴别检测H3、H4、H6和H9亚型AIV的多重RT-qPCR方法,为AIV基因分型和流行病学调查提供便捷的技术手段。; 龙凤熊陈勇施开创郑敏林昌华林宝江杜忠韦显凯冯淑萍屈素洁陆文俊李剑锋周明旭尹彦文; 关键词：禽流感病毒荧光定量RT-PCR TAQMAN

盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立: 2025年; 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。; 顾志刚郭洁真王子涵孙彤陈鸿军孙竹筠陈丹清; 关键词：盖塔病毒 TAQMAN探针实时荧光定量RT-PCR

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