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单克隆接种/成像设备VIPS在CHO工程细胞株单克隆筛选中的应用
2023年
目的探讨应用单克隆接种/成像设备VIPS(Verified In-situ Plate Seeding)建立CHO工程细胞株单克隆筛选的方法。方法采用VIPS将稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 1分别于含不同组合(共18种组合,编号1~18)及体积(100和200μL/孔)培养基的96孔板中进行单细胞接种,并进行单克隆源性追踪拍照,根据图像结果,计算单克隆接种率、克隆形成率、单克隆增殖速率,评价单克隆源性图像效果。通过稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4验证该方法的适用性。结果最适单克隆培养基为MediumⅡ,培养基体积为100μL/孔。最佳工艺条件下,Cell pool 1的单克隆接种率为80%,克隆形成率为83%,增殖速率较快,单克隆源性图像清晰。Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4在最佳工艺条件下,单克隆接种率均值为78%,克隆形成率均值为67%,增殖速率略有差异,细胞分裂过程图像均清晰。结论采用VIPS建立的CHO工程细胞株单克隆筛选方法可提高CHO工程细胞株的克隆形成率,且能够提供充分的单克隆源性证明。
谢涛彭秀娥孙青张朝陈文烨张宽
关键词:CHO细胞工程细胞株
表达重组蛋白的CHO工程细胞株的低代谢高表达方法
本发明提供表达重组蛋白的CHO工程细胞株的低代谢高表达方法,将表达重组蛋白的CHO工程细胞株以1.0×10<Sup>6</Sup>‑3.0×10<Sup>6</Sup> cells/mL的初始密度进行培养,并在0‑24h...
冯若飞李向茸李洪珊杨妍梅谢晶莹
不同降温温度对抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长及蛋白表达的影响
2022年
目的摸索适合抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长和抗体蛋白表达的降温温度,为细胞培养工艺的建立提供参考。方法在体积为125 mL的培养瓶中,按50万个/mL的初始密度接种CHO工程细胞种子,采用补料分批培养模式,在转速125 r/min,CO_(2)浓度5.0%,湿度80%的温控培养摇床中进行细胞培养。对照组培养温度设定为37℃恒温;试验组初始培养温度设定为37℃,待培养瓶中的细胞密度达到1000万个/mL时,将培养瓶分别转到35℃、34℃和33℃的摇床继续培养。每日取样,分别检测培养液的活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸、NH^(+)_(4)、渗透压和抗体蛋白滴度。当细胞活率<80%时,停止培养。与对照组比较,选择细胞生长较好,代谢副产物浓度较低且抗体蛋白滴度最高的温度为最终降温温度。结果对照组的最高活细胞密度为2000万个/mL,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃培养条件下的最高活细胞密度分别为2210万、1940万和1890万个/mL;与对照组相比,试验组培养后期的细胞活率维持较高水平;葡萄糖、乳酸和NH^(+)_(4)代谢趋势一致,且试验组代谢副产物乳酸和NH^(+)_(4)浓度低于对照组;各培养组渗透压变化趋势一致,都在可接受范围内;最终抗体蛋白滴度对照组为1196 mg/L,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃的分别为1772、1962和1929 mg/L。结论选取34℃为破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株的降温培养温度,进行后续培养工艺的建立。
宋兰兰叶星南建军郭岚徐玺丰张祺陈继军
关键词:工程细胞株中国仓鼠卵巢细胞补料分批培养细胞代谢蛋白表达
表达纳米抗体CHO工程细胞株的构建及优化
本课题研究目的:构建表达纳米抗体哺乳动物中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO工程细胞株,通过对比两种不同载体对纳米抗体(Nanobody,Nb)表达量的影响后,得到适用于表达目标蛋白的最优载...
林健芬
关键词:CHO
表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性分析被引量:1
2021年
目的分析表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的传代稳定性,确定细胞的生产稳定代次。方法取表达rhGH-fc融合蛋白的CHO细胞(35代),连续传代建立50、70、90代细胞库。复苏各代次细胞并进行培养表达,绘制不同代次的细胞生长曲线,比较不同代次细胞在对数生长期的比生长速率;培养结束,对不同代次细胞表达的蛋白进行亲和层析纯化,比较其表达量,Western blot法对表达蛋白进行鉴定,通过对目的基因mRNA测序比较目的基因的稳定性。结果 50和70代细胞与35代相比,生长曲线基本重合,90代细胞曲线出现差异;50、70、90代细胞在对数生长期的比生长速率与35代相比,差异均无统计学意义(P>0.05),但90代的P值已明显降低;50和70代细胞重组蛋白表达量与35代相比,差异均无统计学意义(P> 0.05),但90代细胞重组蛋白的表达量下降比例达42%;各代次细胞rhGH-Fc基因序列保持稳定,与理论一致。结论表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO工程细胞的生产稳定代次为70代,可满足后续研究和生产需要。
许佳慧俞露薛毅勇梁久佳富锐丽王莹李利刘涵
关键词:中国仓鼠卵巢细胞
丙戊酸钠和锌离子对CHO工程细胞抗体产量的影响被引量:2
2021年
目的考察流加补料培养工艺中丙戊酸钠、锌离子及其浓度对表达单克隆抗体的CHO工程细胞抗体产量的影响。方法通过单因素试验筛选丙戊酸钠提高抗体产量的最佳浓度,以及可促进细胞生长并提高抗体产量的流加物质(氨基酸类、维生素类、金属离子等)及其最佳浓度。利用Minitab 17软件考察丙戊酸钠和锌离子两因子的交互作用,得到其最优水平,并进行验证。结果细胞培养第8天单次添加终浓度为1.5 mmol/L的丙戊酸钠,可使抗体产量提高(81.5±9.7)%;锌离子可促进细胞生长并明显提高抗体产量,细胞培养第3天开始,每24 h添加终浓度为90μmol/L的锌离子,可使抗体产量提高(38.3±4.3)%。丙戊酸钠和锌离子组合使用可使抗体产量分别比其单独使用提高27.0%和63.8%。结论组合使用丙戊酸钠、锌离子对CHO工程细胞抗体产量提高的比例明显优于单独使用,可能是丙戊酸钠促进抗体表达的同时抑制细胞生长,限制其提高抗体产量的潜力,锌离子的加入可减弱丙戊酸钠对细胞生长的影响,组合使用可更高效地表达抗体。
宋瑞卿苏杭张玲张路明马宁宁
关键词:丙戊酸钠锌离子
抗PD-1抗体CHO工程细胞株的构建及基于QbD理念的细胞培养工艺开发
抗体药物中,抗PD-1抗体以其对恶性肿瘤作用广谱、副作用低以及患者接受程度好等特点,近年来成为了肿瘤免疫治疗的研究热点。本文构建了生产抗PD-1抗体的工程细胞株,同时在质量源于设计(Qb D)理念的指导下,开发可以稳定生...
付云星
关键词:抗体药物
MG‑132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用
本发明公开了MG‑132在CHO工程细胞表达外源蛋白中的应用。在含有外源蛋白表达基因的CHO细胞,即CHO工程细胞表达外源蛋白时加入MG‑132,能提高外源蛋白的表达量。本发明提供了MG‑132的一种新用途,也提供了一种...
熊盛温家明谢秋玲钱垂文邹纯彬
基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展
2017年
基因编辑技术是近几年迅速发展起来、可实现对基因组进行靶向精确修饰的一种生物技术,通过该技术可对基因进行定位突变、插入或敲除。从最初应用的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)到转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs),再到近两年愈加火热的CRISPR/Cas9系统,随着新基因编辑工具的不断发掘,对基因组进行定向改造的工作将变得更加高效精准、方便快捷。
蔡俊立胡泽斌沈毅珺
关键词:工程细胞株CHOFINGER基因片段靶向基因敲除
抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达
2016年
目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。
费保进雷韬姜晓李小娇沈虎聂艳桃
关键词:人表皮生长因子受体2单克隆抗体中国仓鼠卵巢细胞

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陈昭烈
作品数:145被引量:366H指数:8
供职机构:军事医学科学院生物工程研究所
研究主题:细胞培养 动物细胞 微载体 无血清培养基 CHO工程细胞
吴本传
作品数:66被引量:95H指数:5
供职机构:军事医学科学院生物工程研究所
研究主题:CHO工程细胞 无血清培养基 组织型纤溶酶原激活剂 细胞密度 无血清
刘红
作品数:242被引量:716H指数:12
供职机构:中国医学科学院北京协和医学院
研究主题:基因多态性 华法林 细胞培养 成肌细胞 重组腺病毒
李世崇
作品数:99被引量:160H指数:6
供职机构:军事医学科学院生物工程研究所
研究主题:细胞培养 外源基因 无血清培养基 细胞 人工转录因子
肖成祖
作品数:127被引量:508H指数:14
供职机构:军事医学科学院生物工程研究所
研究主题:尿激酶原 转基因动物 多孔微载体 细胞培养 动物细胞