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新型冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的建立与应用: 2024年; 目的:以新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(PLpro)为靶点,利用荧光共振能量转移(FRET)技术,建立用来筛选PLpro抑制剂的高通量筛选(HTS)模型。方法:通过大肠杆菌原核表达系统进行质粒构建、原核表达、分离纯化,获得高活性PLpro(以FRET检测PLpro生物活性),用的底物为两端被荧光基团Edans与淬灭基团Dabcyl修饰的多肽。通过优化实验条件,建立并评价PLpro抑制剂FRET高通量筛选模型,筛选苗头化合物。结果:利用大肠杆菌原核表达系统成功表达并分离出PLpro,其比活力>3000 U/mg。经过优化实验,确定模型筛选条件:设定HEPES缓冲液(pH 7.0)中NaCl浓度为50 mmol/L,孵育温度为25℃,孵育时间为30 min,PLpro浓度为18μmol/L,底物浓度为2μmol/L。测得Z′因子值为0.74,说明所建模型可用于高通量筛选。通过对天然产物化合物库进行筛选,发现十七烷一烯银杏酸(GA17∶1)对PLpro具有混合型抑制作用且IC50值为15.5μmol/L。结论:成功建立PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步确定GA17∶1是一种新型抗PLpro的苗头化合物,该筛选方法对于快速筛选新型冠状病毒PLpro的靶向抑制剂具有十分重要的意义。; 戚海燕闫干干闫浩浩刘志成刘晓丽刘晓平陈云雨; 关键词：新型冠状病毒高通量筛选

基于细胞的TMPRSS2抑制剂高通量筛选模型建立与应用: 2024年; 跨膜丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)是人体中广泛存在的细胞表面蛋白,参与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)等多种病毒的感染和前列腺癌细胞侵袭、肿瘤生长和转移过程等。本研究使用Boc-Gln-Ala-Arg-AMC作为表征TMPRSS2切割活性的底物,在过表达TMPRSS2的Vero E6细胞(Vero E6/TMPRSS2)中建立了TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型,通过对国家新药(微生物)筛选实验室天然与合成化合物纯品库进行高通量筛选,得到了7个具有TMPRSS2抑制活性的低毒化合物。表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)检测证明所得抑制剂均可与TMPRSS2发生中等强度的结合,且呈现浓度依赖性;细胞-细胞融合实验表明,所得抑制剂可通过抑制TMPRSS2切割SARS-CoV-2 S蛋白,抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合的发生,呈现浓度依赖性;假病毒活性评价结果显示,小分子抑制剂对野生型SARS-CoV-2假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞表现出不同程度的抑制活性。本研究成功建立了细胞模型用于TMPRSS2抑制剂的高通量筛选,并初步证实筛选所得的抑制剂具有体外抗TMPRSS2活性的作用,为抗SARS-CoV-2的新药研发提供了新结构骨架。; 尤宝庆周雯雯李妍张晶司书毅; 关键词：高通量筛选模型表面等离子共振

高通量筛选模型的构建方法、高通量筛选方法及相关装置: 本申请实施例公开了一种高通量筛选模型的构建方法、高通量筛选方法及相关装置，先获取在多肽工程菌质粒的突变位点处设计好特定引物的质粒作为目标质粒，并获取拼接了锚定蛋白基因和质粒框架的目标质粒作为第一质粒组装片段。接着获取经过...; 陈洁洁韦婷婷虞盛松俞汉青

一种用于筛选FXR激动剂的高通量筛选模型: 本发明属于分子生物学和药理学领域，公开了一种用于筛选FXR激动剂的高通量筛选模型，具体公开了一种FXR反应元件，包括hSHP_FXRE、hBSEP_FXRE和hMDR2_FXRE，所述hSHP_FXRE的核苷酸序列如SE...; 郑志民黄晓霞庞碧滢黄娜娜孔波

新冠病毒主蛋白酶抑制剂三明治样荧光偏振高通量筛选模型的建立与应用: 目的:新冠病毒主蛋白酶（main protease,Mpro）通过水解多聚蛋白质体（pol-yprotein）调控病毒RNA复制与免疫逃逸,且人体不存在其同源蛋白酶,这使Mpro成为抗新冠病毒药物开发的理想靶标之一。本研...; 闫干干; 关键词：荧光偏振高通量筛选

游动放线菌产阿卡波糖高通量筛选模型的建立及优化被引量：4: 2023年; Actinoplanes sp.SE50是Ⅱ型糖尿病治疗药物阿卡波糖的主要生产菌株,但是目前阿卡波糖高效检测方法仍存在瓶颈问题。该文采用酶标仪检测技术和孔板发酵构建阿卡波糖高通量检测模型,显著增强阿卡波糖高产菌株的筛选效率。首先,酶标仪检测结合孔板发酵结果表明,24孔板发酵与摇瓶发酵的相关性(R 2=0.88161)优于48孔板发酵(R 2=0.83374)。24孔板发酵实验结果表明,孔板发酵存在边缘效应即阿卡波糖产量中间孔1区<长边缘孔2区<短边缘孔3区,对边缘孔填充无菌水可有效消除边缘效应。随后,为减少种子液培养工序,通过正交优化培养基中黄豆饼粉、甘油、碳酸钙的添加量,得出黄豆饼粉3%,甘油1.5%,碳酸钙0.4%(均为质量分数)配比最佳。最后,在最优条件下孔板发酵168 h,阿卡波糖产量可达到(2183.66±6.60)μg/mL。该文介绍了一种孔板发酵结合酶标仪检测筛选方法,大幅缩短了摇瓶发酵液相检测所需工作量及时间,为快速筛选阿卡波糖高产菌株奠定了基础。; 周健李翔飞李闯刘坤赵世光薛正莲; 关键词：阿卡波糖高通量发酵优化

一种用于筛选FXR激动剂的高通量筛选模型: 本发明属于分子生物学和药理学领域，公开了一种用于筛选FXR激动剂的高通量筛选模型，具体公开了一种FXR反应元件，包括hSHP_FXRE、hBSEP_FXRE和hMDR2_FXRE，所述hSHP_FXRE的核苷酸序列如SE...; 郑志民黄晓霞庞碧滢黄娜娜孔波

新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用被引量：9: 2022年; 基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。; 闫干干李东升戚海燕付正豪刘晓平张晶陈云雨; 关键词：荧光共振能量转移高通量筛选白花丹素银杏酸

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用: 目的:在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的复发和转移过程中,β-catenin/TCF4相互作用使经典Wnt信号通路高度活化,促进了肿瘤干细胞(cancer stem ce...; 付正豪; 关键词：酶联免疫吸附实验高通量筛选白花丹素

基于膜电位检测原理的γ-氨基丁酸A型受体药物高通量筛选模型: 2022年; 目的利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABA_(A)R)的药物高通量筛选模型。方法采用α_(1)β_(2)γ_(2L)-GABA_(A)R-CHO细胞株构建GABA_(A)R药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50%激动效应浓度(EC_(50))和EC_(80)浓度下的激活值(ASV)和Z′因子作为判定指标,对缓冲液反应体系、激动剂GABA激活浓度、染料种类和染料孵育时间进行优化选择;在优化条件下分别利用激动剂GABA(0.05,0.25和1.00μmol·L^(-1))、阳性变构剂地西泮(Dia,1,5和30μmol·L^(-1))和拮抗剂加巴嗪(gabazine,Gab,0.1,1.0和10.0μmol·L^(-1))进行方法稳定性考察;通过工具化合物GABA,Dia和Gab的剂量-效应关系检测,考察方法灵敏度。结果构建的方法分别实现了对不同药理性质化合物GABA,Dia和Gab的特异性检测;通过方法优化获得的优化条件为:在GABAEC_(20)~EC_(50)激活浓度下,采用5μL含氯体系加样,对使用红色染料孵育30~50 min的GABAAR-CHO细胞进行工具化合物检测;对不同浓度GABA,Dia和Gab检测的CV%分别介于4.09%~15.30%,5.59%~8.30%和5.65%~15.64%;通过对3种工具化合物的剂量-效应关系检测,获得GABA和Dia的EC_(50)值分别为(137.4±26.3)nmol·L^(-1)和(3.5±0.7)μmol·L^(-1),Gab的50%抑制效应浓度为(164.9±36.6)nmol·L^(-1)。结论本研究建立并优化了高通量检测方法,该方法特异性好、精密度高、稳定可靠、灵敏度高,为靶向GABA_(A)R的先导化合物发现提供了良好的技术基础。; 张毅石童张瑞华陈学军靳倩石晶晶王陈李丽琴; 关键词：高通量筛选地西泮膜电位细胞模型

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