目的原核表达链亲和素-补体3d(SA-C3d)融合蛋白,体外探索蛋白活性。方法以C3 c DNA为模板扩增出C3d段DNA,使用一步克隆法将C3d段与酶切后的质粒p ET-24a-6His-SA-IL15相连,获得SA-C3d原核表达质粒。将测序正确的质粒转化入表达感受态大肠杆菌Rosetta中,诱导蛋白表达。使用镍柱亲和层析及梯度逐级减低的变性剂脲素透析复性的方法获得目的蛋白。通过锚定生物素化的MB49细胞实验反映SA的功能,通过促进Raji细胞生长的实验检测C3d的功能。结果成功构建SA-C3d原核表达质粒,通过镍柱纯化与透析复性获得高纯度目的蛋白。该蛋白特异性的与生物素化的MB49细胞结合,促进Raji细胞增殖并呈现剂量依赖效应,体现蛋白SA-C3d具有双功能活性。结论成功制备的SA-C3d融合蛋白可在体外与生物素化的MB49细胞结合并促进Raji细胞增殖。
目的:筛选重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)肝损伤大鼠高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:牛黄胆酸钠胆胰管逆行注射法制备SAP大鼠模型,与对照组同时处死,取肝组织提取细胞核蛋白,PCR扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将核蛋白与HMGB1探针孵育,然后用链亲和素磁珠分离HMGB1启动子-蛋白复合物,分别用0.25 mol/L和1 mol/L NaCl洗脱探针上结合的蛋白,用SDS-PAGE电泳分离样本蛋白,SilverQuest银染试剂染色,比较SAP组和对照组的差异条带并做质谱鉴定.结果:对照组和SAP组共有14条差异条带,质谱鉴定这些差异条带得到H2A、H2B、H3、H4、S100A9转录相关蛋白.结论:该研究筛选到一些SAP肝损伤特异性的HMGB1启动子结合蛋白,对于下一步研究HMGB1在SAP肝损伤过程中的转录调控机制具有重要意义.
