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基于Stefin抗原兔豆状囊尾蚴病间接ELISA检测方法的建立: 2025年; 【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包被条件、封闭条件、血清稀释度、酶标二抗稀释度、反应时间、温度等条件,以阳性血清与阴性血清的D_(450 nm)比值(P/N)作为判断标准优化反应条件,并对ELISA方法的敏感性、特异性、重复性进行检测。【结果】测定了重组蛋白浓度。间接ELISA检测方法临界值为0.352。阳性血清稀释倍数至1∶12800时,D_(450 nm)的值仍大于临界值。兔球虫、兔弓形虫等阳性血清检测显示D_(450 nm)均小于0.352。【结论】Stefin蛋白可以大批量获得,以stefin作为抗原建立的间接ELISA检测方法可以应用于豆状囊尾蚴病的诊断和流行病学调查研究,对豆状囊尾蚴病的有效防控具有重要的意义。; 王由森石正发车亮张月玥羊倩倩李甲肖琴孙晓林王泽祥; 关键词：豆状囊尾蚴 BRADFORD 间接ELISA

兔豆状囊尾蚴CPI Stefin免疫调节功能研究: 豆状囊尾蚴病是豆状带绦虫(Taenia pisiformis)的中绦期——豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)感染家兔等啮齿类动物的一种寄生虫病。该病在全球范围内普遍存在,尤其在发展中国家和资源有限...; 车亮; 关键词：豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂生物信息学 RNA干扰

Stefin蛋白对人工感染豆状囊尾蚴家兔的免疫保护作用: 2024年; 检测重组蛋白Cpstefin免疫家兔的抗体消长水平并验证其对豆状囊尾蚴感染的免疫保护效果。将本实验室保存的转化重组质粒pGEX-4T-Cpstefin的BL21(DE3)菌种活化,采用IPTG诱导表达后收集菌体进行SDS-PAGE分析鉴定后,运用GST琼脂糖树脂纯化Stefin蛋白,检测重组蛋白浓度。将测定好浓度的重组蛋白分别与弗氏佐剂、206佐剂、氢氧化铝佐剂按1∶1体积比充分乳化后免疫家兔。首次免疫300μg/只,加强免疫200μg/只,每次免疫间隔7 d,共免疫3次,并于第2次加强免疫1周后检测家兔外周血液抗体水平。免疫第30天每只家兔经口感染2000个豆状带绦虫虫卵,攻虫后第58天将家兔安乐死,计数囊荷数并计算各免疫组的减囊率。攻虫后每7 d耳缘静脉采血,检测血清抗体水平。结果显示,对各组家兔注射重组蛋白抗原后,免疫组家兔抗体水平开始升高,经口感染虫卵后,免疫组抗体水平有所下降,但D_(492 nm)值仍保持在2.50以上。剖检家兔计算减囊率,弗氏佐剂组、206佐剂组、氢氧化铝佐剂组减囊率分别为76.70%、66.02%和54.37%。结果表明,豆状囊尾蚴Cpstefin重组蛋白对实验感染豆状囊尾蚴家兔具有免疫保护作用。; 李甲羊倩倩王由森肖琴孙晓林王泽祥; 关键词：豆状囊尾蚴抗体消长免疫保护

基于TPO18基因蛋白的兔豆状囊尾蚴感染间接ELISA检测方法的建立: 2024年; 豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫(Taenia pisiformis)的幼虫——豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)寄生于家兔等啮齿类动物所引起的一种寄生虫病,该病威胁养兔业发展和兔肉食品安全。为了鉴定TPO18抗原在豆状囊尾蚴和豆状带绦虫的分布,并建立兔豆状囊尾蚴病抗体间接ELISA检测方法,本研究原核表达兔豆状囊尾蚴18 kDa抗原,经蛋白纯化获得了可溶性的TPO18蛋白。TPO18蛋白免疫家兔制备了效价达1∶51200多克隆抗体。蛋白免疫印迹鉴定多克隆抗体与兔豆状囊尾蚴总蛋白、豆状带绦虫总蛋白及重组蛋白TPO18的反应原性,免疫组织化学法鉴定兔豆状囊尾蚴和豆状带绦虫虫体TPO18抗原分布,多克隆抗体与兔豆状囊尾蚴总蛋白、豆状带绦虫总蛋白及重组蛋白TPO18具有良好的反应原性,兔豆状囊尾蚴TPO18抗原主要分布于生发层和绒毛层,豆状带绦虫TPO18抗原主要分布在吸盘及吸盘周围和集合管上层细胞及绒毛层。以TPO18重组抗原包被酶标板,优化确定间接ELISA各项技术参数,建立基于TPO18抗原的间接ELISA抗体检测方法。经优化后的ELISA检测方法的检测条件为血清稀释度1∶100,抗原包被质量浓度为5 mg/L,抗原包被条件37℃1 h+4℃过夜,封闭条件1%BSA 37℃封闭60 min,血清反应时间60 min,酶标二抗稀释度1∶1000,酶标二抗作用时间60 min,底物反应时间15 min,临界值0.295。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明,该方法灵敏度较高,特异性较好,不与兔瘟、兔肝片吸虫、兔球虫、兔弓形虫等的阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于7%,重复性良好。运用该ELISA方法与剖检检测试验分别对86份临床血清样品检测,两种方法检测结果符合率为97.7%。综上所述,本研究成功建立了兔感染豆状囊尾蚴抗体的间接ELISA方法,为兔感染豆状囊尾蚴后感染情况监测提供了新的监测方法。; 王泽祥罗永禄薛萍车亮王由森苟惠天孙晓林; 关键词：酶联免疫吸附试验特异性敏感性

豆状囊尾蚴小胞外囊泡可抑制家兔外周血淋巴细胞NLRP3活化: 2024年; 本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔,分离不同感染时期的外周血淋巴细胞(PBLC),检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时,收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物(ESP),并通过超速离心分离小胞外囊泡,用ESP和小胞外囊泡分别处理PBLC,24小时后,利用qPCR和Western-blot分析炎症小体相关基因的表达变化。结果显示,家兔感染后第30天和60天,炎症小体相关基因NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显升高,而在感染第90天时明显下降;用ESP处理PBLC后,NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平也明显升高;而用小胞外囊泡处理细胞后,虽然IL-1β的表达水平升高,但NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显受到了抑制。说明豆状囊尾蚴可通过其ESP或小胞外囊泡调控家兔PBLC炎症小体的活化,从而达到其长期生存和持续感染的目的。; 蒲桂婷王立群刘婷丽王得先曹珊菱郭小腊殷宏骆学农; 关键词：豆状囊尾蚴

兔豆状囊尾蚴Ⅰ型胱抑素对脂多糖诱导小鼠脓毒症防治机制的研究: 2024年; 为深入探究兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)超家族成员I型胱抑素(Stefin)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒症的治疗效果,本研究将重组菌pGEX-4T-CpStefin/BL21经IPTG诱导表达重组Stefin蛋白(r-Stefin),采用GST试剂盒纯化上述蛋白,并去除内毒素后,采用SDS-PAGE检测r-Stefin的纯化效果。结果显示,r-Stefin在大肠杆菌中获得了表达且纯化效果较好。将雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组16只,分别为A组(生理盐水100μL/只,阴性对照组)、B组:GST蛋白对照组(25μg/只)、C组:r-Stefin组(25μg/只)、D组:脓毒症组(0.2 mg/100μL LPS/只)、E组:GST蛋白干预组(0.2 mg/100μL/只LPS+GST蛋白25μg/只)、F组:r-Stefin干预组(0.2 mg/100μL LPS/只+r-Stefin 25μg/只)。经腹腔注射后观察各组小鼠的临床症状、绘制各组小鼠在LPS诱导后不同时间的生存率曲线。在LPS诱导后12 h和24 h对各组小鼠采血,采用ELISA检测各组小鼠血清中各炎性细胞因子的含量,通过全自动生化仪测定各组小鼠血清中肝、肾功能指标。结果显示,D、E组小鼠经LPS诱导后很快出现被毛发凌乱、活动量减少、精神沉郁等症状。F组小鼠上述症状在一定程度上得到改善。A、B、C组小鼠均健活。生存率曲线显示,D组小鼠在36 h内全部死亡,E组小鼠在48 h~60 h时的生存率由75%快速降至72 h时的37.5%,F组小鼠的生存率在72 h时达75%。A~C组小鼠生存率均达100%。ELISA结果显示,LPS诱导12 h时,D组、E组和F组小鼠血清中促炎细胞因子(IL-6、TNF-α和TNF-β)及抑炎细胞因子(IL-10)的含量与A组相比均极显著升高;D组小鼠血清中IL-10含量显著低于F组。TNF-α及TNF-β含量分别极显著和显著高于F组。LPS诱导24 h时,D组小鼠血清中IL-6、TNF-α和TNF-β含量极显著高于F组,IL-10含量极显著低于F组。经LPS诱导后12 h,D组、E组、F组小鼠血清中肝脏指标ALB的含量与A组相比均极显著下降(P<0.001),ALT含量均极显著升高。D; 车亮王由森石正发李甲羊倩倩肖琴孙晓林; 关键词：半胱氨酸蛋白酶抑制剂小鼠脓毒症脂多糖

一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物及应用: 本发明公开了一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物，所述miRNA标志物为novel‑miR‑1，其序列为GCAGGUGCGAAAGCAGGUA。所述miRNA标志物，来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调...; 骆学农陈国梁刘婷丽李艳萍白雪王立群刘晓雷郭小腊

基于novel⁃miR1检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增方法的建立和应用被引量：1: 2023年; 目的建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法。方法以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel⁃miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel⁃miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只经口感染1000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果。结果电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2∶1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P<0.01)。ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95%,AUC为0.9550,似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性。结论建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3�; 陈国梁王立群李艳萍刘婷丽李红张少华骆学农强文军; 关键词：豆状囊尾蚴病滚环扩增

兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备被引量：1: 2023年; 【目的】旨在克隆兔豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)Stefin基因(CpStefin),原核表达并纯化兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,制备多克隆抗体并测定其效价。【方法】根据GenBank登录的猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin基因序列设计引物,以提取的兔豆状囊尾蚴总RNA为模板,运用RT-PCR方法克隆兔豆状囊尾蚴Stefin基因,构建克隆载体pMD-19TCpStefin,分析Cpstefin蛋白氨基酸序列的二级结构、理化性质、结构域,并分析其与其它绦虫Stefin基因的亲缘关系,构建系统进化树。以克隆载体pMD-19T-CpStefin为模板扩增兔豆状囊尾蚴Stefin基因,回收纯化的扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-CpStefin,双酶切、测序结果与预期结果一致。重组质粒pGEX-4T-CpStefin转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达获得重组蛋白。应用亲和层析法纯化可溶性CpStefin重组蛋白,进行SDS-PAGE鉴定。重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,运用ELISA方法测定其效价。【结果】首次克隆兔豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,基因大小约为290 bp,成功构建克隆载体pMD-19T-CpStefin;菌液PCR和双酶切鉴定结果表明重组质粒pGEX-4T-CpStefin构建正确,通过IPTG诱导表达获得分子质量大小约为35 kU的可溶性融合蛋白,亲和层析法纯化获得纯度较高的CpStefin重组蛋白,制备出的多克隆抗体效价达到1∶25600。【结论】本研究首次克隆出豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin基因,运用原核表达系统可溶性表达豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin蛋白,纯化获得纯度较高的豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂CpStefin重组蛋白,制备的多克隆抗体效价达到1∶25600。; 王泽祥张国强王由森罗永禄薛萍白玉婷柳春霞; 关键词：豆状囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶抑制剂原核表达纯化多克隆抗体

豆状囊尾蚴外泌体let--7--5p调节宿主外周血Treg细胞分化的机制及诊断靶标研究: 豆状囊尾蚴病呈全球性分布，给养兔业造成了很大经济损失。研究报道,豆状囊尾蚴外泌体可诱导巨噬细胞向M2表型极化，与绦虫蚴引起的免疫抑制有关。而且小RNA测序发现，豆状囊尾蚴外泌体富含let-7-5p。那么，豆状囊尾蚴外泌体...; 王立群; 关键词：豆状囊尾蚴病外泌体 TREG细胞细胞分化

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