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一种欣氏波氏杆菌荧光定量PCR方法
本发明公开了一种欣氏波氏杆菌荧光定量PCR方法,涉及生物工程技术领域,其技术要点为:步骤S1、以标准质粒作为DNA模版,对引物进行荧光PCR扩增,绘制得到欣氏波氏杆菌扩增CT值之间的标准曲线;步骤S2、用引物对检测检样品...
张雪青冯育芳邢进付瑞
猪FoxP3、IL-10双重实时荧光定量PCR方法建立及应用
2025年
旨在建立双重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对叉头框蛋白P3(FoxP3)、白细胞介素10(IL-10)的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针,优化引物浓度、退火温度,建立RT-qPCR方法,检测猪圆环病毒2型(PCV2)感染外周血调节性T淋巴细胞(Treg)和免疫器官中FoxP3和IL-10的mRNA含量;根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果:建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线,相关系数R^(2)≥0.99;转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素17(IL-17)等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线,最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中FoxP3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高,FoxP3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值,IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值,PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中FoxP3和IL-10转录水平升高;Western blot检测表明,FoxP3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天,IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组,与RT-qPCR结果一致。综上,本研究建立的猪FoxP3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点,对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。
王艳萍徐倩倩孟卫芹王金良魏凤魏凤董林谢金文
关键词:FOXP3IL-10实时荧光定量PCR
F亚群禽白血病病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立
2025年
为精准检测F亚群禽白血病病毒(ALV⁃F),该研究针对ALV⁃F流行毒株env基因设计了一对特异性引物F1/F2,建立了ALV⁃F的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。条件优化试验结果显示,该方法最适退火温度为64.5℃,最适引物浓度为0.4μM。利用最适反应条件建立的标准曲线方程为y=-3.303x+42.525,R2=0.997,扩增效率E=100.8%,重组质粒标准品拷贝数与Ct值具有良好的线性关系。特异性试验结果表明,该方法仅能特异性检测ALV⁃F,对ALV⁃A、ALV⁃B、ALV⁃J、ALV⁃K、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)、网状内皮组织增生病病毒(REV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)无交叉反应;敏感试验结果表明,该方法最低检测限度为4.67×10^(2)拷贝/μL,敏感性是普通PCR的1000倍;稳定性试验结果表明,批间和批内稳定性试验的变异系数均小于2%。利用该方法、ALV p27 ELISA和普通PCR方法分别对23份七彩山鸡胚所制备的原代细胞(PEF)样品进行检测,结果显示该方法和普通PCR方法阳性检出率均为95.65%(22/23),而ALV p27 ELISA阳性检出率仅为39.13%(9/23),该方法与普通PCR总符合率为100%,与ALV p27 ELISA总符合率为43.48%;进一步利用该方法、病毒分离法(结合ALV p27 ELISA)和普通PCR方法分别对20份七彩山鸡抗凝血样品进行检测,结果显示该方法和普通PCR方法阳性检出率分别为100.00%(20/20)和75.00%(15/20),两者总符合率为75.00%,而病毒分离法阳性检出率为0.00%(0/20)。本研究建立的方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,能够有效检测临床样品,可以为ALV⁃F的精准检测提供技术支持。
潘洪艳李锦群李琪袁伊琳曹伟胜
关键词:禽白血病
BVDV-1型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立与初步应用
2025年
本研究构建了一种牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)的高效临床检测方法。利用SYBR Green I荧光定量PCR扩增BVDV-1保守基因5'UTR的片段(124 bp),并构建重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,同时采集临床样品,评价其检测效率。结果显示:BVDV-1阳性标准品在1.169×10^(8)~1.169×10^(1)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数R^(2)=0.997,熔解曲线无非特异性峰产生;重复性试验组内和组间变异系数低于2%;敏感性试验最低检测拷贝数为1.169×10^(1)拷贝/μL,为普通PCR的100倍;特异性良好,与BEV、BEFV、IBRV、BPIV3无交叉反应产生。采用建立的BVDV-1 SYBR GreenⅠ荧光定量方法检测62份牛腹泻粪便样品,阳性率为46.77%,高于普通PCR^(2)0.97%。本研究成功建立了BVDV-1荧光定量方法,该方法特异性强,灵敏度高,重复性稳定,可用于养殖业BVDV-1临床的快速检测。
付兢锋陈姗马浩原祝昆儒牟碧莹薛皓文宋彦昊李强高旭
关键词:牛病毒性腹泻病毒荧光定量
蜂蜜中嗜渗酵母菌TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立
2025年
【目的】建立蜂蜜中嗜渗酵母菌的快速检测方法,为保障蜂蜜品质提供理论基础。【方法】根据GenBank中嗜渗酵母菌26S rDNA D_(1)~D_(2)基因序列设计特异性引物,PCR扩增获得嗜渗酵母D_(1)~D_(2)基因片段,构建重组质粒pMD-18T-JM为阳性标准品,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立嗜渗酵母菌TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,并对160份蜂蜜样品进行验证。【结果】建立的蜂蜜中嗜渗酵母菌TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度达0.004 pg/μL。TaqMan实时荧光定量PCR检测阳性率达98.5%,比普通PCR检测(阳性率84.1%)高14.4百分点,检测敏感性达100%。【结论】嗜渗酵母菌TaqMan探针实时荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速、重复性好,适合于蜂蜜中嗜渗酵母菌的快速检测。
姜玲玲罗文菊雷露周景瑞艾蓉余波
关键词:蜂蜜探针荧光定量PCR
猪细小病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用被引量:1
2025年
本研究通过对猪细小病毒(PPV)1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计,建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,实现了对PPV1的快速检测。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×10^(10)copies/μL~1.0×10^(4)copies/μL范围内具有良好的线性关系,曲线回归方程为y=-3.6186x+42.01,R^(2)=0.99,扩增效率为189%;重复性好,组内与组间变异系数均低于1.0898%;敏感性好,最低检测限为1.0×10^(1)copies/μL;特异性强,不与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒发生交叉反应,并用该方法对临床样品与病毒拷贝数进行了检测。表明本研究建立的方法重复性好、敏感性高、特异性强,适用于对PPV进行临床检测与诊断。
帅文娜郭子强李佳乐罗梦李丽薇周艳君周艳君童武姜一峰李兆龙童武
关键词:猪细小病毒NS1蛋白
一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒
本发明涉及微生物检测技术领域,且公开了一种荧光定量PCR方法的肠道菌群定量检测试剂盒,包括:荧光定量PCR反应液、菌株标准品、对照品。荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、特异性上下游引物、特异性探针。PCR反应缓冲...
张茂好
禽源大肠杆菌荧光定量PCR方法的构建及应用被引量:1
2024年
为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×10^(2)~4.69×10^(9 )copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R2=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×10^(2) copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。
高艺玮田堯孙少迪牛灵玥文立华杨俊王红兵王慧杜丽飞刘俊琦刘俊琦
关键词:禽源大肠杆菌实时荧光定量PCR
一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法
本发明公开了一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法,所述方法包括:根据旋毛虫iss195株染色体的Scfld4基因设计引物;将提取的旋毛虫基因进行倍比浓度稀释,对所述倍比浓度稀释的旋毛虫全长基因样本分别利...
杨娜陈启军王彦虎桑晓宇姜宁冯颖陈冉丁莹莹
B型禽偏肺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用
2024年
试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方法用于临床样品的检测。结果显示:建立的TaqMan荧光定量PCR方法只能检测出B亚型aMPV,其敏感性能达到1.34×10^(1) copies/µL,斜率为-3.346,截距为40.01,相关系数(R2)为1.00,循环阈值(Ct)与模板拷贝数之间呈现良好的相关性;临床样品检测结果显示,该方法检测出18份样品阳性,而普通PCR仅检测出10份阳性。综上所述,建立的aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法在样品检测中表现出良好的特异性和较高的敏感性,适用于临床样品的aMPV-B检测。
沈海强车艳杰宋新宇高冉付旭彬金天明
关键词:G基因实时荧光定量PCR

相关作者

闫丽萍
作品数:58被引量:303H指数:8
供职机构:中国农业科学院上海兽医研究所
研究主题:病毒 E蛋白 抗原表位 蛋鸭 黄病毒
王吉
作品数:134被引量:253H指数:9
供职机构:中国食品药品检定研究院
研究主题:实验动物 PCR检测方法 ELISA 小鼠 实验小鼠
付瑞
作品数:171被引量:337H指数:11
供职机构:中国食品药品检定研究院
研究主题:实验动物 PCR检测方法 小鼠 ELISA 实验小鼠
岳秉飞
作品数:412被引量:890H指数:13
供职机构:中国食品药品检定研究院
研究主题:实验动物 小鼠 封闭群 PCR检测方法 近交系小鼠
贾广乐
作品数:93被引量:265H指数:8
供职机构:中国检验检疫科学研究院
研究主题:Q热 荧光PCR 猪链球菌2型 探针 引物