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TaqMan-MGB探针实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 检测肺炎支原体方法的建立 被引量：1 2015年 荧光 定量 一聚合酶 链反应 （real-timePCR）快速检测方法，为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan—MGB探针，建立并优化real—timePCtt检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价，并与已报道的肺炎支原体荧光 PCR方法进行比较。结果本研究建立的TaqMan—MGB探针荧光 PCR方法对肺炎支原体的检测限为0．2cfu，比普通TaqManreal—timePCR检测限（3—5cfu）提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（R^2=0．999）。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体，结果均为阴性，特异度为100％。结论TaqMan—MGB探针real—timePCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体，有很好的应用前景与价值。关键词：肺炎支原体 TAQMAN-MGB探针 模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 检测方法 被引量：3 2014年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光 探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应 。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。关键词：单增李斯特菌 PCR 利用实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌 被引量：2 2013年 反应 条件,建立实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应 体系。利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的最低检测限为500 fg/反应 ,相当于97个拷贝/反应 。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104cfu/g,增菌后可达50 cfu/g。结论基于STY1633基因的实时荧光 定量 PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。关键词：伤寒沙门菌 伤寒 弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 检测方法的建立 被引量：1 2013年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real time-PCR)检测方法。方法针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度;对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性;使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性。结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0×101拷贝/反应 体系;该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增。该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0×102cfu/ml的菌量;通过对1.0×107、1.0×105和1.0×103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90%～3.91%;组间变异系数为1.52%～1.69%。结论本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法。实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 方法检测肺炎支原体 被引量：16 2013年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real-time PCR)检测方法,以期用于临床肺炎支原体感染检测。方法通过测序分析和序列比对,选取肺炎支原体p1基因中保守区域设计特异性引物和荧光 探针,建立和完善此real-time PCR检测方法,并进行扩增效率、灵敏度及特异度评价。与已报道的肺炎支原体常规聚合酶 链反应 (PCR)方法进行150份临床标本检测能力比较。结果建立的real-time PCR方法对肺炎支原体的检测限约为10 cfu。使用该方法对9株肺炎支原体ATCC标准株和30株临床分离株核酸扩增均为阳性;对10种其他支原体、13种常见呼吸道病原菌染色体及人类染色体扩增结果均为阴性。同时,临床标本的检测结果显示该方法检测灵敏度优于常规PCR。结论本研究建立的real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测标本中肺炎支原体核酸,可适用于临床肺炎支原体诊断。关键词：肺炎支原体 REAL-TIME PCR TaqMan MGB探针实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立 被引量：4 2012年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real-time fluorescence quantitative,FQ-PCR)方法,用于人粒细胞无形体病的检测。方法根据无形体特异外膜蛋白Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针,建立FQ-PCR方法,并对湖北省随州和河北省张家口地区的蜱标本进行了检测。结果本研究建立的TaqMan MGB探针具有良好的特异性,建立的FQ-PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μl PCR反应 管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。共检测蜱标本426只,其中豪猪血蜱253只,共49组,阳性7份。结论本研究建立的FQ-PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于人粒细胞无形体感染的快速检测。进一步证实了豪猪血蜱可能是粒细胞无形体的媒介宿主。关键词：人粒细胞无形体 REAL-TIME PCR 实时荧光 定量 -聚合酶 链反应 检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究 被引量：8 2009年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (real-time PCR)技术,建立食品中金黄色葡萄球菌(金葡萄)污染的快速敏感特异的检测方法。方法以金葡菌的FemB基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以金葡菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以金葡菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应 体系在引物和探针的浓度为0.8μmol/L、0.6μmol/L,Mg2+浓度为3.5 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除金葡菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,最低检测限为44 cfu/m。l稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均<5%。检测样品结果显示real-tim e PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。关键词：食品 金黄色葡萄球菌 TAQMAN探针 荧光定量PCR 荧光 定量 -聚合酶 链反应 技术产前快速诊断染色体异常的临床应用被引量：3 2007年 关键词：染色体异常 聚合酶链反应技术 荧光定量 染色体核型分析 18号染色体 荧光 定量 -聚合酶 链反应 法快速检测麻疹病毒核酸被引量：12 2007年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (FQ-PCR)法,检测麻疹病毒核酸,用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法:TaqMan特异性荧光 标记探针法,进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果:FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性,本次试验检测灵敏度达0.1 TCID50。在14份麻疹患者咽拭子标本中,有13份标本检出麻疹病毒核酸,从核酸提取至完成检测仅需3 h。结论:FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。关键词：FQ-PCR 荧光 定量 —聚合酶 链反应 检测慢性非细菌性前列腺炎病原体216例结果分析被引量：1 2006年 荧光 定量 -聚合酶 链反应 (FQ-PCR)对216例NBP患者同时检测CT、UU。结果:NBP患者CT、UU的感染率分别为15.28%、37.50%,混合感染率为6.48%。结论:UU、CT是NBP的主要病原体。关键词：沙眼衣原体 解脲支原体 荧光定量-聚合酶链反应
