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PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立: 2025年; 目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量; 吴钊淳李友何嘉文廖科棋李胜男

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株: 2025年; 背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。; 郭大鑫范苏苏朱振东侯建红张旋; 关键词：慢病毒载体过表达 RAW264.7细胞

GPx6过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建: 2024年; 为了建立稳定表达谷胱甘肽过氧化物酶6(Glutathione peroxidase 6,GPx6)的真核表达细胞系,对GPx6进行基因克隆,构建慢病毒表达载体,建立表达猪源GPx6的CHO-K1细胞系.根据NCBI数据库中的猪GPx6基因的c DNA序列,利用Primer5设计PCR扩增引物.在猪附睾组织中克隆出6His-GPx6基因,构建含有6His-GPx6的慢病毒过表达载体,利用三质粒包装系统进行慢病毒包装,慢病毒侵染CHO-K1细胞,进一步筛选获得阳性单克隆细胞系,通过免疫荧光、蛋白印迹和实时荧光定量确定目的基因表达效果.试验成功克隆出6His-GPx6基因,构建了含有6His标签的GPx6过表达慢病毒载体,并成功获得了含有GPx6的CHO-K1细胞系.为下一步研究GPx6在猪繁殖力的提高和精液稀释液添加剂的应用提供新思路.; 陈云宋文静蓝珊珊卫恒习李莉张守全; 关键词：慢病毒转染

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立: 2024年; 目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。; 李胜男何嘉文廖科棋李友; 关键词：稳定转染

ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法及应用: 本发明涉及生物医学领域，公开了ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法，包括慢病毒包装和病毒浓缩和慢病毒感染DLBCL细胞；还公开了构建的细胞株的应用。本发明构建的细胞株有助于拓宽对DLBCL发病机制的认识...; 王慧睿郭淑利肖蓬莉刘思哲彭靓陈聪唐莉黄磊李治

稳定转染TDP-43导致NSC34细胞自噬异常: 2024年; 目的探讨稳定转染TDP-43对NSC34细胞自噬的影响。方法体外培养稳定转染空质粒的NSC34细胞系(E细胞)和转染TDP-43的NSC34细胞系(TDP-43细胞)。应用CCK-8试剂盒测定两组细胞活力,应用EdU试剂盒测定两组细胞增值能力,应用透射显微镜观察两组细胞线粒体形态,应用免疫荧光检测两组细胞自噬相关蛋白表达水平。结果与E组细胞相比,TDP-43组细胞活力明显下降,增殖能力下降,差异有统计学意义(P<0.05);线粒体形态异常,自噬相关蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P <0.05)。结论稳定转染TDP-43可导致NSC34细胞自噬异常,线粒体形态改变,降低细胞活力和增殖能力。; 杨静刘亚玲李震中李睿张雷杜风萍白琳王亚飞; 关键词：肌萎缩侧索硬化自噬

EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立: 2024年; 目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,各组在相对分子质量49000处出现特异性条带,提示Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达成功;与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞中EIF4A3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA; 何嘉文李友廖科棋李胜男; 关键词：短发夹RNA 慢病毒

EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用: 本发明提供了一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法以及通过该方法获得的稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的B淋巴瘤细胞株。本发明通过设计特异性的引物序列，并通过大量实验确定了最优的转染方法和转染条件，从而比...; 孙明姝张令歌罗兵刘雯

稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用: 本发明公开了稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法，包括如下步骤：1)慢病毒转染；2)超速离心；3)细胞感染和第一次流式荧光分选；4)第二次流式荧光分选。本发明属于基因工程技术领域，本发明通过将慢病...; 李道传姜姝芸徐驰王庆

恶性疟原虫基因稳定转染方法的研究进展: 2023年; 恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的转染有助于研究其基因的功能,例如抗药性。但转基因操作一直都非常具有挑战性,主要是由于疟原虫基因组的高A/T碱基序列结构(A+T含量约为82%)以及低转染效率。基于电穿孔的恶性疟原虫转染方法已成功应用于某些基因的研究中,而预载法的电穿孔是目前将外源DNA引入恶性疟原虫的首选方法。疟原虫基因的定点编辑多采用双质粒转染的方法,通常认为对疟原虫的成功转染需要大量高纯度质粒DNA以及精确的转染体系。本文除对目前常用的电转方法进行了评价外,还介绍了一种新的转染方法,即裂解-再密封红细胞转染(lyse-reseal erythrocytes for transfection),并对质粒DNA浓度、转染试剂的使用、转染参数的设置、新鲜红细胞的添加以及转染成功的标记等因素在提高疟原虫转染成功率和效率方面的作用等进行综述,为该领域研究提供参考。; 李晓松潘茂华黄亚铭杨照青; 关键词：恶性疟原虫稳定转染质粒DNA

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