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一种高效无选择标记的黑曲霉基因组编辑方法被引量：3: 2022年; 黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业生产菌株,被广泛地应用于生产酶制剂和有机酸,但仍需要进行基因组改造提高它的应用潜力。CRISPR/Cas9技术是一种被广泛采用的黑曲霉基因组编辑技术,但由于需要在基因组中整合选择标记或基因编辑效率还有待提高,影响了其在工业菌株改造中的应用。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9技术的高效无选择标记的基因编辑方法。首先,利用5S rRNA启动子启动sgRNA的表达,构建了一个含有AMA1(autonomously maintained in Aspergillus)复制起始片段的sgRNA和Cas9共表达质粒;同时通过敲除kusA基因构建非同源末端连接(non-homologous end joining pathway,NHEJ)修复缺陷的高效同源重组菌株;最后利用含有AMA1片段质粒的不稳定性,通过无抗平板传代丢失含有sgRNA和Cas9共表达质粒。利用该方法,在采用同源臂长度仅为20 bp的无选择标记供体DNA进行基因编辑时,基因编辑效率可达到100%。该方法为黑曲霉基因功能的研究和细胞工厂的构建奠定了基础。; 申玉玉陈忠秀陈杰赵宝顶吕佳桂玲路福平黎明; 关键词：黑曲霉无标记同源重组

一种关于无选择标记转基因水稻基因漂移频率的测定方法: 本申请提供了一种关于无选择标记转基因水稻基因漂移频率的测定方法，包括：获取并种植转基因水稻和基因漂移受体，计算基因漂移受体的出芽率，并且进行取种，取种后培养得到杂交幼苗；根据外源基因设计特异性分子标记，并且通过特异性分子...; 唐傲董文军刘猷红孟英来永才张喜娟孙兵夏天舒王立志谢婷婷

用于修饰芽孢杆菌属基因组的无选择标记方法及其组合物: 提供了用于在不使用可选择标记和不使用受指导的Cas内切核酸酶的情况下修饰芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞的基因组的方法和组合物。本公开包括用于在不使用可选择标记和不使用Cas内切核酸酶进入芽孢杆菌属物种细胞...; F·O·本德苏S·I·R·斯塔布斯

一种优化的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用: 本发明公开了一种获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用。本发明创造性的将其载体系统中整个诱导删除系统和选择标记基因表达框置于两个loxP/FRT删除位点之间；同时在删除位点外还引入了两个同向排列的MAR序...; 朱祯刘哲铭戴艳张磊魏晓丽

一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法: 本发明涉及一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法，该载体通过以下步骤构建：1)将绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(mCherry)潮霉素抗性选择标记基因(HPT)、来源于玉米的Ac转座酶基因(Ac...; 瞿绍洪李莘潘龙玉毕冬玲李利华田旭丹王岚岚龙文莉许赵蒙刘中来赵建华邹小维高晓庆杨海河曲海艳

无选择标记转基因大白菜的检测被引量：1: 2020年; 通过对转基因大白菜进行TuMV-C4病毒摩擦接种鉴定、ELSIA检测、提取转基因大白菜DNA进行PCR检测,并通过PCR-Southern杂交、RT-PCR检测转基因大白菜,构建了针对无选择标记转基因大白菜的系统检测方法。试验结果表明:转基因大白菜通过摩擦接种TuMV-C4病毒抗病性鉴定,188株表现为抗性,初步筛选率为19.46%;进行ELISA检测抗病植株中TuMV含量,有63株明显低于非转化植株,筛选率达到26.25%;对抗TuMV植株直接进行目的基因PCR检测,有25株呈阳性,筛选率达到13.30%。经PCR-Southern杂交检测和RT-PCR检测,表明转基因大白菜中不仅整合了Nib基因,而且获得了表达。这种逐级递进的检测系统可以高效地获得无选择标记的转基因植株。; 佟容于占东吴春燕乔宏宇乔建磊王彧彧张新影; 关键词：RT-PCR 大白菜

一种无选择标记的株型改良的水稻育种新材料的获取方法: 本发明公开了一种无选择标记的株型改良的水稻育种新材料的获取方法，构建以pCambia1300载体为模板扩增增强子序列，利用Giboson Assemble片段组装试剂盒将以上回收的四个片段连接成目的载体p35SBRD3；...; 刘文真付亚萍胡国成

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻被引量：1: 2020年; 水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。; 潘龙玉李军王歆刘中来赵建华刘雄伦戴良英毛雪琴瞿绍洪; 关键词：共转化

一种优化的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用: 本发明公开了一种获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用。本发明创造性的将其载体系统中整个诱导删除系统和选择标记基因表达框置于两个loxP/FRT删除位点之间；同时在删除位点外还引入了两个同向排列的MAR序...; 朱祯刘哲铭戴艳张磊魏晓丽

构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型: 本发明公开了构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型。在该构建过程中，关键是重组质粒pOPAI1B的构建，pOPAI1B中含有发光所需酶基因<I>LuxCDABE</I>，抗性筛选基因<I>...; 张天宇曹元元伍甜谭守勇谭耀驹蔡杏珊刘春平

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