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罗非鱼戴维斯黄杆菌实时定量PCR检测方法的建立及应用
2024年
戴维斯黄杆菌(Flavobacterium davisii)是柱形病病原之一,严重影响罗非鱼养殖产业.为了实现对其快速和准确的诊断,本研究以TonB基因为靶基因构建了重组质粒,建立了戴维斯黄杆菌的实时定量PCR检测方法,并将其应用到罗非鱼感染戴维斯黄杆菌后的载菌量测定研究.结果表明:特异性引物TonB-F/R与不同基因型的黄杆菌及罗非鱼其他常见病原无交叉反应,所建立的绝对定量检测方法是常规PCR检测方法灵敏度的100倍,其重复性和稳定性良好;罗非鱼感染戴维斯黄杆菌后其鳃组织载菌量显著高于其他组织,符合该疾病的侵染特点.综上所述,该实时定量PCR检测方法具有快速、高灵敏度和强特异性等优势,可准确评估戴维斯黄杆菌的感染程度,对柱形病的预防具有重要价值.
叶小灵许莹萱王世锋王世锋郭伟良周永灿
关键词:罗非鱼实时定量PCR检测
CHO细胞外源抗体基因拷贝数实时定量PCR检测方法的建立及验证被引量:1
2024年
目的 采用SYBR GreenⅠ染料建立实时定量PCR检测CHO细胞外源抗体轻链(light chain,LC)、重链(heavy chain,HC)基因拷贝数,并进行方法的验证及初步应用。方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因,分别设计适宜的LC和HC基因引物及内参基因引物,确定实时定量PCR方法的反应体系和反应程序。对建立的方法进行特异性、线性、精密性及耐用性验证,并采用建立的方法检测重组细胞株工作细胞库(WCB)及不同传代次数细胞中LC和HC基因拷贝数。结果 外源基因与内参基因引物可特异性结合目标片段;B2m、LC、HC基因引物扩增效率分别为106.7%、106.3%和99.1%,线性方程相关系数均大于0.99,具有良好的线性关系;精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%;短时间内少次冻融对检测结果影响较小。利用建立的方法检测不同代次重组细胞株LC和HC基因拷贝数,未见明显变化。结论 成功建立了CHO细胞外源基因拷贝数实时定量PCR检测方法,该方法特异性、线性、精密性及耐用性良好,为其他CHO细胞株表达的外源基因拷贝数检测提供了参考。
张慧高文丽李凤智胡加亮李剑
关键词:实时定量PCRCHO细胞轻链重链基因拷贝数
柑桔衰退病毒RB和VT基因型实时定量PCR检测方法建立和应用
2024年
定量检测样品中柑桔衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)RB和VT基因型含量,以RB基因型的p33基因、VT基因型的ORF1a基因为靶标,建立了RB和VT基因型的特异性实时定量PCR方法。该方法检测RB和VT基因型质粒浓度下限均为2×10^(1) copies/μL,灵敏度为普通PCR的1000倍;对RB和VT基因型进行检测,质粒拷贝数对数(x)与Ct值(y)的标准曲线方程分别为y=-3.3255 x+37.8453和y=-3.2737 x+36.2839,R^(2)分别为0.9991和0.9954,扩增效率分别为99.85%和102.05%;方法的重复性良好,组内和组间Ct值变异系数均小于2.07%。对田间样品检测发现,不同样品之间RB基因型含量差异和VT基因型含量差异均较大。该方法特异性强,灵敏度高,适用于田间样品检测
周俊韩镕琰张晓男方书洁杨欣悦易龙
关键词:柑桔衰退病毒实时定量RT-PCR
柑橘黄化花叶病毒的实时定量PCR检测及其在寄主植株中的时空分布规律被引量:2
2023年
【背景】柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)是首先发现于印度并对其柑橘产业造成严重危害的一种杆状DNA病毒。目前,CYMV已被美国、日本、新西兰、欧洲和地中海地区列入检疫性有害生物名单,具有传入我国的潜在风险。【目的】建立CYMV的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测体系;筛选CYMV敏感柑橘品种;明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监控提供技术支持。【方法】根据NCBI中CYMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列,利用软件Primer Premier 5设计qPCR检测引物8对,通过常规PCR筛选扩增效果好、特异性强的引物。通过对引物浓度、退火温度等反应条件优化,建立CYMV的qPCR检测体系,并进一步通过对不同柑橘病原的检测评价所建体系的特异性;以梯度稀释的1.98×109—1.98 copies/μL的质粒标准品平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的灵敏度;随机采集田间柑橘样品,平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的适用性。将CYMV接种到玉环柚(Citrus grandis)、强德勒柚(C.grandis)、22号枳(Poncirus trifoliata)等15个柑橘品种,进行症状观察和分子检测以筛选敏感指示植物。在接种后不同时间,分别自MV甜橙(C.sinensis)植株不同组织部位取样,以柑橘生长因子1α基因为内参基因,利用所建体系进行qPCR检测,从而明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律。【结果】建立了CYMV的qPCR检测体系,其最佳引物为CYMV-qF7/R7,最佳引物浓度为200 nmol·L^(-1),最佳退火温度为63℃。该检测体系的特异性强,检测灵敏度是常规PCR的1000倍。对来自不同地区的660个田间柑橘样品的检测结果表明,qPCR检测与常规PCR检测结果一致,除阳性对照外均未检测到CYMV阳性植株。不同柑橘品种接种试验结果表明,15个柑橘品种中,玉环柚和强德勒柚最早表现出强烈的黄化花叶典型侵染症状,可以作为敏感�
曹鹏许建建李楚欣王新亮王春庆宋晨虎宋震
关键词:实时荧光定量PCR
石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒
本发明涉及石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒,属于石斑鱼虹彩病毒检测技术领域。本发明解决的技术问题是提供石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物和检测试剂盒。该PCR检测引物的核苷酸序列为:正向引物075R 2...
周永灿张冬冬叶小灵郭家诚王世锋郭伟良邓恒为蔡岩李建龙
磁珠法结合实时定量PCR检测新型冠状病毒灭活疫苗中宿主细胞残留DNA的验证及应用被引量:5
2022年
目的对磁珠法结合实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测新型冠状病毒(简称新冠)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞残留DNA(residual cell DNA,rcDNA)进行验证及应用。方法利用磁珠与溶液中DNA的特异性结合来提取样品中rcDNA。将已知浓度的细胞DNA标准品系列稀释后,根据DNA标准品的循环阈值与浓度之间的线性关系,对未知样品中的rcDNA进行定量分析。对方法进行线性和范围、专属性、准确度、精密度验证,并使用该方法对新冠灭活疫苗(Vero细胞)生产过程样品进行rcDNA及其片段大小检测。结果标准品检测范围为0.0003~30 pg/μL,该方法的标准曲线决定系数(R;)>0.99,扩增效率为90%~110%。质控样品回收率为50%~150%,相对标准偏差(RSD)均小于30%。试验结果的各项参数均符合标准。结论磁珠法可解决rcDNA检测中样品前处理提取DNA的技术难点,qPCR能够简便、快速、准确地对新冠疫苗生产过程中的rcDNA进行定量测定。该方法适用于新冠疫苗中rcDNA的检测及疫苗生产过程和成品的质量控制,对其他采用同样细胞基质的病毒性疫苗质量控制也具有借鉴意义。
周艳萍卢佳李茜林凤杰杨安纳孟胜利王泽鋆申硕
关键词:实时定量聚合酶链反应磁珠法
鸭圆环病毒实时定量PCR检测方法的建立及流行毒株全基因组遗传变异分析被引量:2
2022年
为了解近年来鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)的流行现状,本研究在DuCV的Rep基因保守区内设计一对特异性荧光定量引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法最低可检测到拷贝数为3.46×10^(1)copies/μL的目的基因,比常规PCR灵敏;选取Ct值最低的阳性样品进行全基因组扩增及进化分析,成功扩增出1988 bp的病毒全基因,序列分析结果显示该病毒基因型为DuCV-1,亚型为1 b。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为DuCV的流行病学调查提供了有效的监测手段,同时通过分析不同基因型的遗传进化特点与Cap蛋白氨基酸位点突变特征,为DuCV感染的防控研究提供参考。
赵韵笛杨兴淼李靖红曹瑞兵
关键词:鸭圆环病毒基因进化定量PCR
一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法
本发明公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因的实时定量PCR检测引物组及方法。该引物组包括SOX9引物对、FST引物对、DF引物对或β‑actin引物对。该检测方法包括以下步骤:提取待测达氏鲟样品RNA,以总RNA作为模板,合...
陈叶雨刘亚龙治海林珏龚全赖见生杜军宋明江
用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒
本发明公开了一种用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量PCR检测试剂盒,设计内外引物、探针和PCR扩增条件的选择达到巢式PCR一管法完成,操作过程中避免开盖产生气溶胶污染,提高检测结果准确性。检测...
汤锋格日力樊海宁李润乐赵连娣郑佳张玉英冯琳
一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量PCR检测方法
本发明涉及海参养殖水体青苔爆发的防控与预警领域,具体地说是一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的动态监测方法。长石莼、硬石莼和萱藻是海参养殖池塘青苔爆发的重要种类,但其孢/配子个体较小,传统方法很难检测。通过针...
张倩倩缪栋张晓黎苏蕾包卫洋龚骏

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林江
作品数:193被引量:252H指数:6
供职机构:江苏大学附属人民医院
研究主题:急性髓系白血病 甲基化 白血病患者 慢性髓系白血病 骨髓增生异常综合征
钱军
作品数:234被引量:349H指数:9
供职机构:江苏大学附属人民医院
研究主题:急性髓系白血病 骨髓增生异常综合征 白血病患者 甲基化 慢性髓系白血病
李扬秋
作品数:593被引量:804H指数:13
供职机构:暨南大学
研究主题:TCR T细胞 白血病 基因扫描 克隆性
范磊
作品数:366被引量:518H指数:11
供职机构:江苏省人民医院
研究主题:慢性淋巴细胞白血病 慢性淋巴细胞 预后 淋巴瘤患者 弥漫大B细胞淋巴瘤
王雅丽
作品数:25被引量:39H指数:4
供职机构:江苏大学附属人民医院
研究主题:急性髓系白血病 PML/RARΑ 启动子甲基化 基因启动子甲基化 早幼粒细胞