搜索到3598篇“ 增强型绿色荧光蛋白“的相关文章
- 循环排列的增强型绿色荧光蛋白的构建及性能表征
- 2025年
- 荧光蛋白的自催化稳健荧光和无细胞毒性特性,使其成为监测细胞内信号分子的关键工具。然而,循环排列的荧光蛋白(Circularly Permuted Fluorescent Proteins,cpFPs)仍存在着自身强度弱和无法适用于复杂细胞环境内检测等问题,因此,获得更多类型的循环排列荧光蛋白并研究其光学活性和物理性能具有重要意义。构建一种新型的循环排列荧光蛋白——cpEGFP,并探究不同温度下cpEGFP在Escherichia coli BL21菌株的表达效果,同时比较其与超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的光学特性,发现cpEGFP的发色团环境已经被改变,且荧光寿命有所延长。另外,尽管cpEGFP具有可观的荧光强度,但其亮度及量子产率比sfGFP都有所降低,后续需要进一步对其性能进行优化。研究结果为循环排列荧光蛋白cpEGFP的性能优化以及在细胞内信号分子检测中的应用奠定了基础,对于发展更为高效、特异的荧光探针具有重要意义。
- 王丹宋天宇韦敏
- 关键词：荧光寿命
- 一种可表达增强型绿色荧光蛋白的人胸腺瘤细胞系及制备方法
- 本发明涉及一种可表达增强型绿色荧光蛋白的人胸腺瘤细胞系及制备方法，以EGFP为目的绿色荧光蛋白，先设计并优化得到具有多克隆位点的序列，将其插入到慢病毒表达载体中，再将EGFP插入其中，制备得到含有多克隆位点的荧光重组慢病...
- 张鹏王元国李新陈渊陈渊
- NOD1与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达细胞株的构建
- 2025年
- 建立NOD1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)(EGFP-NFAT2)共表达细胞株。将pcDNA3.1-NOD1-3×Flag-hygro重组质粒转染至U2OS-EGFP-NFAT2细胞,经潮霉素压力筛选后加入脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到46株稳定表达NOD1的细胞株U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1,其中4号细胞株细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1细胞株进行功能验证。采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测该细胞株中NOD1 mRNA水平和Western blot法检测NOD1蛋白的表达水平,结果显示在传代5~20代内NOD1 mRNA均稳定表达,并且该细胞株中可明显表达NOD1蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见NOD1蛋白表达。将U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1细胞接种于96孔板,加入组蛋白(histone)孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFPNFAT2核转位,验证该细胞株NOD1功能的特异性,发现组蛋白在不同浓度范围内使U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1稳转细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加。将U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1稳转细胞株分为溶媒对照组、NOD1拮抗剂nodinitib-1+组蛋白组、组蛋白组。药物孵育时间均为30 min。通过高内涵筛选系统观测EGFP-NFAT2核转位,结果表明与组蛋白组比较,nodinitib-1+组蛋白组EGFP-NFAT2核转位较明显减弱(P<0.05)。以上结论表明成功构建了共表达NOD1和EGFP-NFAT2的稳转细胞U2OS-EGFP-NFAT2-NOD1,可用于靶向NOD1的病原微生物的抗性化合物筛选及其分子机制研究。
- 王佳琪李玉蕾雍政周培岚苏瑞斌
- 关键词：组蛋白
- 脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建
- 2024年
- 携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。
- 徐超杨晓炼朱书
- 关键词：脑心肌炎病毒嵌合病毒
- 一种高效表达增强型绿色荧光蛋白的重组冠状病毒基因组及其重组冠状病毒的制备方法和应用
- 本发明属于重组病毒及生物医药技术领域，具体涉及一种高效表达增强型绿色荧光蛋白的重组冠状病毒基因组及其重组冠状病毒的制备方法和应用。本发明针对人冠状病毒OC43的基因组的ns2编码区域进行改造，采用部分替代的方式将报告基因...
- 谭文杰黄保英 王梦微叶飞 管琼阁
- 表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化被引量：1
- 2024年
- 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。�
- 郭禹程晶左玉柱范京惠姜海军
- 关键词：反向遗传系统T7启动子
- α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建
- 2024年
- 目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数�
- 王晓璇李玉蕾周培岚苏瑞斌
- 关键词：核转位去甲肾上腺素
- 基于COL1A1启动子和增强型绿色荧光蛋白基因建立人肝星状细胞活化的细胞模型
- 2023年
- 目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动子序列。在pLVX-AcGFP1-N1质粒基础上构建以COL1A1启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的重组质粒pLVX-COL1A1-EGFP。使用慢病毒包装系统将pLVX-COL1A1-EGFP稳定转染至永生化的人肝星状细胞LX-2中,并筛选单克隆细胞株。对该细胞株使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活及2种具有潜在抗肝纤维化作用的药物处理。使用荧光显微镜及ImageJ 1.49软件对细胞中EGFP荧光强度进行半定量分析,再分别使用逆转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹试验检测胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平。结果:构建了由COL1A1启动子调控EGFP表达的重组慢病毒质粒pLVX-COL1A1-EGFP,并加入了Kozak序列以增强EGFP的表达,获得了稳定转染pLVX-COL1A1-EGFP的LX-2单克隆细胞株LX-2-CE。LX-2-CE经过TGF-β1和具有潜在抗肝纤维化作用的5μmol/L二氢丹参酮Ⅰ共处理24 h后,其总荧光强度和平均荧光强度均低于TGF-β1单处理组(P<0.05);胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平同样均低于TGF-β1单处理组(P<0.05)。结论:成功构建了基于COL1A1启动子调控EGFP表达的肝星状细胞活化的报告系统,可在体外直观报告肝星状细胞活化相关标志物COL1A1表达,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。
- 王磊金香淑董慧君欧国敏赖鑫源庄辉李彤向宽辉
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白
- 增强型绿色荧光蛋白标记膀胱癌外泌体的构建及其体外示踪作用
- 2022年
- 目的 构建稳定表达CD63-增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合蛋白的膀胱癌细胞株,得到EGFP标记的膀胱癌外泌体,进行外泌体的体外示踪。方法 将CD63基因通过分子克隆插入pLVXEGFP-puro质粒中,构建CD63-EGFP融合蛋白的表达载体。通过慢病毒转染得到稳定表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞株,超速离心法提取外泌体,使用透射电子显微镜、粒径分析和Western blot鉴定外泌体。通过共培养的方式检测人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对膀胱癌外泌体的摄取情况。结果 构建了稳定表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞株,其分泌的外泌体符合外泌体经典特征,并发现SV-HUC-1细胞和PBMC中的单核细胞可在体外摄取膀胱癌外泌体。结论 表达CD63-EGFP融合蛋白的膀胱癌细胞能分泌出荧光外泌体,可用于外泌体的体外示踪。
- 陈辉侯爱华王培培梅晓峰
- 关键词：膀胱癌外泌体增强型绿色荧光蛋白示踪
- Copine-3-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白在细胞中的表达和定位
- 2021年
- 目的构建增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)-N1-CPNE3真核表达载体,检测Copine-3蛋白在细胞中的表达和定位。方法利用RT-PCR从人支气管上皮细胞(HBE)中扩增得到编码Copine-3蛋白的CPNE3基因,并亚克隆至p EGFP-N1真核表达载体。将酶切鉴定和测序正确的pEGFP-N1-CPNE3重组质粒转染293T和H1299细胞。激光扫描共焦检测Copine-3-EGFP融合蛋白的细胞定位,Western blotting检测亚细胞组分中Copine-3蛋白的表达,免疫组织化学检测肺腺癌患者癌临床样品中的Copine-3蛋白定位。结果编码Copine-3蛋白的CPNE3基因克隆到了p EGFP-N1真核表达载体中,并在293T和H1299细胞中表达。通过免疫荧光染色、Western blotting和免疫组织化学确定Copine-3蛋白定位于细胞质和细胞核。结论成功构建p EGFP-N1-CPNE3真核表达载体,Copine-3蛋白定位于细胞质和细胞核。
- 李游徐丽明张琦敏杨素芳卢春花
- 关键词：支气管上皮细胞免疫荧光免疫印迹法
